艾納香（Blumea balsamifera L），別名管芽，假東風草[1]、大風艾、大艾、*艾等，屬于菊科艾納香屬多年生木質(zhì)草本植物，在我國主要產(chǎn)于廣西、貴州、云南、廣東等省[2]，以其全草或地上部分入藥，具有鎮(zhèn)痛、發(fā)汗、祛風除濕、去痰止咳、通經(jīng)止血等功效，是一種重要的民間藥物。作為天然中草藥，艾納香含有多種有效成分，已經(jīng)鑒定的有黃酮類、有機酸、萜類等[3-5]。同時，艾納香是天然龍腦的重要來源，艾納香精油中含30%左右龍腦[6]，是名貴藥材、香料、化妝品的理想原料及食品保健品的添加劑。
艾納香屬多年生宿根植物，主要以宿根分株繁殖，分生苗移栽成活率低;艾納香利用種子育苗發(fā)現(xiàn)種子結(jié)實率低、休眠期長、發(fā)芽率低[7，8]。這些情況導致艾納香種苗短缺，嚴重制約了艾納香的規(guī)?；a(chǎn)，因此必須研究艾納香的組織培養(yǎng)以快速獲得批量種苗，擴大種植規(guī)模以滿足日益增長的市場需求。此外，在進行組織培養(yǎng)時，直接以組織培養(yǎng)物替代原藥材是解決艾納香資源短缺的重要方法。對不同培養(yǎng)條件下的艾納香中龍腦含量進行比較，有利于擴寬艾納香藥材的應(yīng)用，使這一古老的中藥為人類健康發(fā)揮更大的作用。
1 材料與方法
1.1 儀器
7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent公司）。
1.2 試劑
龍腦對照品，無水乙醇。
1.3 供試材料
艾納香組培愈傷組織;艾納香組培苗由貴州民族大學化學與環(huán)境科學學院組織培養(yǎng)實驗室培養(yǎng)了7個月的組培苗;艾納香野生苗采自貴州羅甸縣。
1.4 龍腦對照品溶液的制備
稱取龍腦對照品10 mg，置于10 mL的容量瓶中，加無水乙醇溶解并加至刻度，搖勻，即可得到濃度為1 mg/mL的溶液，作為標準品貯備液;另取200、300、400、500、600 μL的貯備液，分別置于10 mL容量瓶中加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液備用，濃度分別為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL。
1.5 氣質(zhì)聯(lián)用條件
1.5.1 色譜條件 采用HP-5MS氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;進樣口溫度為280 ℃，采用程序升溫，柱溫起始溫度為90 ℃，以5 ℃/min升溫至100 ℃，維持3 min;再以5 ℃/min升溫至150 ℃，維持2 min;分流比為40∶1;載氣為高純氦氣，載流速度為1.0 mL/min;進樣量為1.0 μL。1.5.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊粒子源，電離能量為70 eV;離子源溫度為230 ℃;傳輸線溫度為210 ℃;四級桿溫度為150 ℃。
1.6 樣品的處理
分別將艾納香愈傷組織、艾納香組培苗、野生苗3種樣品用研缽粉碎，準確稱取粉碎樣品8 g，放至250 mL的錐形瓶中，加無水乙醇100 mL，進行超聲提?。ǔ晻r間為120 min，頻率為59 Hz，功率為80%），冷卻、搖勻、過濾，濾液置于100 mL容量瓶中，放冷，加無水乙醇至刻度，搖勻，從100 mL容量瓶中再取1 mL溶液，置10 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，即為樣品溶液。
1.7 龍腦對照品的氣質(zhì)聯(lián)用分析
分別從0.03 mg/mL的龍腦對照品溶液及樣品溶液中精密量取1 μL溶液，運用氣質(zhì)聯(lián)用儀進行測定。
1.7.1 標準曲線的繪制 分別精密吸取濃度為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的龍腦對照品溶液各1 μL，依次進樣，運用氣質(zhì)聯(lián)用儀分別測定其峰面積，以龍腦對照品的峰面積為縱坐標，龍腦對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
1.7.2 精密度測定 取濃度為0.03 mg/mL的龍腦對照品溶液1 μL，連續(xù)進樣6次，根據(jù)峰面積計算其相對標準偏差。
1.7.3 重復(fù)性試驗 取艾納香野生苗，按照樣品溶液制備方法配制6份100 mL的溶液，根據(jù)氣質(zhì)聯(lián)用法依次對6份供試品溶液進行測定，記錄樣品的峰面積，計算其相對標準偏差。
1.7.4 加標回收率試驗 分別稱取艾納香組培苗和貴州羅甸野生苗各0.04 g，制備成樣品溶液，從中各取出6份，先測出藥材中龍腦的含量，再向每份中加入0.300 mg龍腦對照品，由氣質(zhì)聯(lián)用儀測定6個樣品峰面積，計算平均回收率以及相對標準偏差。
1.7.5 樣品含量的測定 分別量取愈傷組織供試品溶液、組培苗供試品溶液和野生苗供試品溶液各1 μL依次進樣，測定出峰面積，計算供試品溶液中龍腦的含量，每份平行測定3次。
2 結(jié)果與分析
2.1 龍腦對照品溶液及樣品溶液氣質(zhì)聯(lián)用分析
從0.03 mg/mL的對照品溶液及樣品溶液中精密量取1 μL溶液進樣，從圖1至4可以看出，龍腦標準品的出峰時間在7.621 min;樣品色譜圖在7.621 min有一吸收峰與龍腦標準品保留時間一致;質(zhì)譜圖檢索結(jié)果為龍腦成分。
2.2 線性關(guān)系分析
以龍腦的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，見表1、圖5，計算回歸方程為：y=173.602 5 x，R2為0.997 01。結(jié)果表明，龍腦在0.02～0.06 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好（n=5）。
2.3 精密度測定結(jié)果
由精密度試驗方法，用氣質(zhì)聯(lián)用儀進行分析，結(jié)果見表2，其相對標準偏差（RSD）為0.44%。表明方法的精密度良好。
2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果
根據(jù)重復(fù)性試驗考察方法，由氣質(zhì)聯(lián)用儀進行測定，結(jié)果見表3。
由表3可得，6份供試品溶液中龍腦平均含量為3.621 6 mg/g，RSD為0.16%，表明方法的重復(fù)性好。
2.5 加標回收率試驗結(jié)果
測得組培苗中龍腦的平均回收率97.11%，RSD為1.14%;野生苗中龍腦的平均回收率97.78%，RSD為0.67%，表明該方法的準確度高（表4）。
2.6 樣品含量的測定
從表5可以得出艾納香組培苗中龍腦的平均含量為3.216 7 mg/g，貴州羅甸艾納香野生苗中龍腦的平均含量為3.620 0 mg/g。
3 小結(jié)與討論
在擬定的色譜條件下，以無水乙醇作為艾納香中龍腦的提取溶劑，采用超聲提取，簡化了樣品的制備方法，而且艾納香中龍腦的含量測定沒有受到其他成分的干擾。氣質(zhì)聯(lián)用儀用于檢測揮發(fā)性物質(zhì)靈敏度高、準確度好。運用該方法，在對照品標準溶液中，色譜圖中龍腦出峰的時間在7.621 min，愈傷組織的色譜分析顯示，在該時間處沒有吸收峰，這說明愈傷組織中不存在龍腦。組培苗、羅甸野生苗質(zhì)譜圖分析確定是龍腦，其中組培苗中龍腦的含量較野生苗低，但差異不大，原因可能是組培苗培養(yǎng)時間較短，龍腦在植物體內(nèi)有一個逐步累積的過程。但組培苗可以人工快速培育繁殖，縮短培育周期，為艾納香藥材應(yīng)用提供大量的苗木，以滿足日益增長的市場需求。
