古朵生物技術| 細胞培養(yǎng)、凍存、復蘇的流程

　　一、準備工作

　　準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調試，具體內容可參閱有關文獻。

　　二、取材

　　在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定)，經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的shou次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

　　理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。

　　由組織并分離分散細胞的方法可參閱有關文獻。

　　三、培養(yǎng)

　　將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細胞培養(yǎng)，一般應在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量(以每毫升細胞數表示)接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。

　　正在培養(yǎng)中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示)，此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。

　　一般原代培養(yǎng)進入培養(yǎng)后有一段潛伏期(數小時到數十天不等)，在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。

　　培養(yǎng)正在生長中的細胞是進行各種生物醫(yī)學實驗的良好材料。

　　四、凍存及復蘇

　　為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—-196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，蕞終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。

　　復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。

　　凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響

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