動物支氣管炎病毒(AIBV)核酸檢測實驗

2023年11月07日 09:43通派（上海）生物科技有限公司點擊量：476

實驗?zāi)康模?/p>

檢測動物體液、腎臟、淋巴結(jié)、咽、泄殖腔試子、肺臟等組織標本以及細胞培養(yǎng)液中傳染性支氣管炎病毒(AIBV)RNA，適用于傳染性支氣管炎病毒(AIBV)感染的輔助診斷及流行病學調(diào)查，其檢測結(jié)果僅供參考。

實驗原理：

選取一對支氣管炎病毒(AIBV)特異性引物和一條特異性熒光探針，應(yīng)用Trizol提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，后者在Taq酶作用下，配以FQ-Buffer(內(nèi)含Mg2+、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，用一步PCR熒光探針法對禽傳染性支氣管炎病毒(AIBV) RNA進行擴增，從而達到快速檢測之目的。

標本采集：

1）：咽及泄殖腔等試子標本采集：用棉試子取咽或泄殖腔分泌物，將試子放入盛有1.0ml PBS(或生理鹽水)的離心管中，立即送檢。

2）：組織標本采集：取動物肺、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)及胰腺等組織約1g，置入1.5ml潔凈EP管，立即送檢。

3）：體液及培養(yǎng)液體標本采集：取上述標本約1ml，置入1.5ml潔凈EP管，立即送檢。

實驗方法：

1）：樣品處理：

培養(yǎng)物、試子等液體標本：將標本充分混勻，取100μ液體標本加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents）充分震蕩，室溫放置5min。

固體組織：取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents），研磨或振蕩至勻漿狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml的EP管中，室溫放置5min。

2）：加入100μl氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min，4℃ 13,000rpm離心5min。

3）：小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加300 μl 無水乙醇，另加10μl RNA提取液B（內(nèi)含不溶物，使用前室溫溶解并充分混勻），充分混勻，13,000rpm離心1min。

4）：.棄上清，加入500μl 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13,000rpm離心1min，小心吸去大部分乙醇。

5）：.將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈，用20µl DEPC H2O溶解沉淀。

陰性質(zhì)控品：取100μl陰性質(zhì)控品加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents）充分震蕩，室溫放置5min。后按1.2~1.5操作。

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